O enredo desse filme de ação e fantasia é centrado no personagem-título, uma equidna vermelha antropomórfica chamada Knuckles, um alienígena com superpoderes, ex-aluno do Dr. Eggman e atual amigo de Sonic e Foxy Tales. Tendo se tornado um herói amigável e positivo, ele está pronto para ajudar qualquer pessoa em dificuldade, pois aprendeu a verdade — é difícil ficar sozinho sem ajuda. Ele já foi deixado como o único membro de sua tribo, que foi exterminada por corujas sanguinárias. Knuckles fez um juramento de lealdade a seus novos amigos, e essa é a única coisa que o mantém na Terra, pois o sentimento de vingança é o mais forte que ele sente por seus inimigos.
O trio de amigos Red, Yellow e Blue, ou seja, Knuckles, Tales e Sonic, salvaram o mundo recentemente e, no momento, podem desfrutar da paz e não fazer nada, mas o corpo ativo da equidna exige trabalho, e ele começa a «transformar em herói» seu amigo humano, o xerife Wade Whipple, para o qual ele não está preparado. Enquanto isso, um novo inimigo aparece no horizonte do herói: Shadow the Hedgehog. Knuckles também lutará contra inimigos que tentam tirar seu poder sobrenatural. O comprador, que trabalhava para o Dr. Eggman, está obstinado a obter o poder de Knuckles e contrata dois assistentes para equipá-los com um novo dispositivo.
