O misterioso protagonista do filme original — o caçador de tesouros Ben Gates (Nicolas Cage), cujo nome completo é Benjamin Franklin Gates — retorna às telas com novas e emocionantes aventuras. Ao lado de seu pai, Patrick (John Voight), cujo segundo nome é Henry, Ben descobre que seu trisavô, Thomas Jefferson, ajudou a impedir que os Cavaleiros da Cidade Dourada — uma seita renegada da Confederação que atuava após o fim da Guerra Civil — obtivessem um mapa do tesouro na cidade famosa por suas riquezas, o que poderia ter dado aos confederados derrotados uma segunda chance. Ben Gates decide aproveitar essa oportunidade e localizar a Cidade Dourada e, nela, o mapa do tesouro. No entanto, ao longo de sua jornada, o protagonista descobre que não é o único à procura da Cidade Dourada. Um certo Mitch Wilkinson (Ed Harris) possui informações extraídas de uma página perdida do diário de John Wilkes Booth, segundo as quais Thomas Jefferson seria um dos principais nomes na lista dos conspiradores que assassinaram Abraham Lincoln. Agora, Ben tem mais uma missão: provar que seu trisavô não assassinou o 16º presidente. No fim das contas, Gates conta com o apoio de sua ex-namorada Abigail (Diane Kruger), de seu melhor amigo Riley (Justin Bartha), que consegue invadir qualquer sistema, e também de seus pais, e parte para uma viagem emocionante por diversos locais de importância histórica. Juntos, eles descobrem pistas que os levam a outro local de interesse histórico. No fim, eles descobrem que o Monte Rushmore, na verdade, esconde um enorme segredo e que a Cidade do Ouro realmente existe.
